聚焦睾丸网注射：男性生殖健康研发的递送新思路
对于布局男性生殖健康、核酸递送或局部给药技术的企业，研发判断不应止于“能否注射成功”。更重要的是：候选物能否到达预定区域、作用于目标细胞，以及相关效果是否具有可解释、可比较的证据。
睾丸网注射为生精小管管腔递送给予了一种研究路径。本文结合小鼠研究，梳理其适用场景、递送系统选择和评价思路，供药物递送与临床前研究的早期研发讨论参考。
01 /睾丸网注射：为什么选择这条路径？
1. 血–睾屏障：理解全身递送的局限
睾丸支持细胞之间的紧密连接构成血–睾屏障（BTB），将生精上皮分为基底与近腔侧区室。它与生精小管基底膜等结构共同影响递送物在组织中的分布。[2]
全身给药后，候选物能否到达相关靶区，还取决于分子或颗粒性质、暴露水平及组织状态。对于需要进入生精小管管腔的载荷，局部路径值得评估，但不能据此认定所有全身给药方案均无效。
2. 解剖优势：借助汇流结构实现管腔递送
生精小管经直精小管汇入睾丸网，再经输出小管与附睾相连。经输出小管朝睾丸网递送时，制剂可沿这一相连系统向生精小管管腔分布。[3]
这一路径利用了管道之间的连通关系，有助于实现较广泛的管腔递送。实际分布范围仍需逐次确认，不能直接写成“一次注射覆盖整颗睾丸”，更不能把管腔充盈等同于全部目标细胞转导。
示意图A｜经输出小管指向睾丸网的局部注射位置关系。依据文献[3]的路径描述绘制；为简化的概念插画，不按真实比例，不代表完整手术规程或固定分布范围。
3. 路径对比：按靶区和载荷选择
◆ 全身给药
用途：经循环到达睾丸；适用性取决于候选物暴露与靶区。
注意事项：评价局部暴露及全身分布，不以固定“阻挡率”概括。
◆ 睾丸间质注射
用途：第一时间进入间质区域；可用于间质相关靶点的局部研究。
注意事项：部分载体可进一步跨越组织屏障，不能一概认定无法影响管内细胞。[2]
◆ 睾丸网管腔递送
用途：经输出小管等通路进入生精小管管腔，适用于相关递送研究。
注意事项：需确认分布、细胞摄取和表达，不能直接认定为“完全穿透”。[2,3]
图B 睾丸网注射与其他给药方式的比较。（A）全身给药（尾静脉/腹腔）：BTB 阻挡，睾丸局部浓度低；（B）睾丸间质注射：载体滞留间质空间，主要感染 Leydig 细胞和管周细胞，难以进入管腔；（C）睾丸网注射：直达管腔，可覆盖支持细胞、生殖细胞、管周细胞和间质细胞。
三条路径并非简单的“低、中、高效”排序。先明确目的细胞与载荷性质，再比较局部暴露、表达和耐受性，才有可解释的选型依据。
进入管腔、细胞表达和功能改善是三个不同的评价层级，需要分别建立证据。
示意图C｜进入管腔、细胞表达与功能评价属于不同层级。图为概念插画，箭头表示评价顺序，不代表必然转化或疗效。
02 /研发场景：连接递送证据与药效证据
药物研发中的三类应用
◆ 核酸与载体筛选：在匹配载荷及检测条件的前提下，比较不同配方或构建的分布、表达与耐受性，明确差异来自递送系统还是表达调控。
◆ 靶点与机制验证：将目标分子的表达变化与细胞表型、组织变化连接起来；机制验证结果不直接等同于候选药物的有效性结论。
◆ 疾病模型中的概念验证：选择与目标机制匹配的模型，事先定义功能终点，并明确观察窗口及结果适用范围。
03 /递送系统选择与表达调控
1. 递送系统 / 载体选择
◆ AAV9：用于小鼠支持细胞、精原干细胞（SSCs）及微环境的递送研究。转导范围需结合给药路径、具体构建和细胞标记确认。[2]
◆ AAVDJ：可参考其在 Lhcgr 缺陷小鼠中对 Leydig 前体细胞的递送研究；该研究采用间质注射，不直接代表睾丸网路径的优势。[4]
◆ LNP-mRNA：用于短期表达、mRNA 补充及配方评价。细胞选择性依赖配方和调控设计；文献结合了 miRNA 调控。记录剂量时应明确 mRNA 质量，不能只报制剂体积。[1]
◆ 质粒＋体内电转：用于报告构建、调控片段与基因功能验证。文献在第3天检测表达；比较时需记录质粒量、浓度及电转条件，并评价操作损伤。[3]
◆ 小分子 / 蛋白：用于局部暴露、机制或药效探索。先确认溶解性、稳定性和局部耐受性，再设计给药条件。
2. 启动子 / 表达调控
◆ 广谱表达策略：CAG、EF1α、CMV 可作为候选元件，但不保证所有细胞均高表达。本文所引 AAV 与质粒方法分别包含 CAG 和 CMV 构建。[2–4]
◆ 支持细胞相关策略：Amh 等需明确片段与发育阶段。特定约5 kb Gata4 上游序列已有支持细胞报告表达证据，不能直接外推到任意短片段或 AAV 构建。[5]
◆ Leydig细胞相关策略：Star、Cyp11a1 等相关元件需在具体载体中验证。调控表达不能替代载体进入目标细胞。
◆ 生殖细胞相关策略：Stra8、Ddx4（Vasa）等需结合细胞阶段及构建验证；mRNA 体系应关注 UTR 与转录后调控。
选择调控元件时，应记录序列来源、片段长度、载体背景及验证模型。基因的天然表达分布，不能直接等同于载体中某一启动子片段的特异性。
3. 参数对照：保留文献条件，不拼接通用剂量
◆ LNP-mRNA研究示例：Mashiko 等的小鼠研究经该通路使用约15 μL制剂，配合示踪观察分布。[1] 这是特定方案的体积示例；实际剂量还需明确mRNA浓度与质量，不能写成所有LNP的推荐值。
◆ 质粒电转研究示例：JoVE方法将所需体积与睾丸大小关联，并强调以示踪观察控制充盈。[3] 与LNP的配方、载荷及辅助处理不同，不宜共用一组“标准注射量”。
◆ AAVDJ研究示例：原研究采用间质途径，以gc/testis表述剂量。[4] 病毒基因组数、核酸质量和制剂体积是不同量纲，应分别报告。
因此，参数表应同时说明物种与年龄、给药路径、载荷量、制剂体积和检测时间；示踪方式与麻醉镇痛按经批准的项目方案确定。
04 /文献案例：有前景，也有明确边界
案例一｜LNP-mRNA 与特定遗传模型的功能改善
Mashiko 等在 Pdha2 缺陷小鼠中研究了 mRNA 补充策略，并结合 miRNA 识别序列调节细胞表达。研究报告了精子产生恢复，随后顺利获得睾丸取精结合卵胞浆内单精子注射（TESE-ICSI）取得后代。[1]
这一结果为特定遗传缺陷模型给予了概念验证，并非证明任意 LNP 配方能够治疗所有非梗阻性无精症，也不能省略取得后代所需的辅助生殖条件。
图1｜LNP 递送与报告表达示例。源自 Mashiko 等，2025，Fig. 1；沿用原稿配图，截取范围以本图所示为准。
案例二｜AAV 与生精微环境的功能研究
Watanabe 等比较了不同 AAV 及局部递送路径，研究支持细胞、精原干细胞及其微环境的遗传操作；在 Kitl 缺陷模型中，经相关构建干预后取得生精恢复，并借助显微授精取得后代。[2]
对研发的启示是：载体、路径、目的细胞和功能终点应共同设计。该研究结果不能被简化为某一血清型或路径在所有模型中的固定优势。
图2｜不同 AAV 及递送路径的转导比较。源自 Watanabe 等，2018，Fig. 1；沿用原稿配图。
05 /评价设计：形成可用于决策的数据
以下为项目设计建议，应按候选药物及递送系统的研究目的确定检测组合，不是统一的标准操作规程。
示意图D｜从明确问题到支持决策的研究设计思路；并非已验证的标准规程。
◆ （1）明确研究问题：先约定目标区域、目标细胞，以及本轮研究要支持的决策，例如保留或淘汰配方、调整表达构建，或优化给药路径。
◆ （2）建立可比较的对照：依据研究目的设置适当对照，明确载荷、路径和操作因素如何区分，并在可行时采用随机分组及盲法评价。
◆ （3）区分分布与表达：将给药区域、细胞定位、表达强度和持续时间分别记录，避免用单一荧光图替代整个递送结论。
◆ （4）连接功能与耐受性：按模型选择功能终点，同时观察组织结构、局部炎症及操作损伤；结果解释应包含取样时间与检测局限。
◆ （5）记录影响重复性的变量：记录动物信息、制剂或载体批次、实际操作条件及偏差。注射体积、示踪方式和麻醉镇痛须依据经批准的项目方案确定。
研究交付宜明确区分：原始观察、统计结果、研究解释与下一步建议。这样，数据才能服务于研发决策，而不仅是证明“做过实验”。
06 /项目沟通：从明确需求开始
欢迎与深圳九游NINE GAME生物科技有限公司研讨相关研发需求。具体合作范围、实验条件与数据交付要求，应在技术沟通中逐项确认。
本文为动物研究与早期研发思路介绍，不构成临床疗效或产品性能承诺。
参考文献
[1] Mashiko D, et al. Sperm and offspring production in a nonobstructive azoospermia mouse model via testicular mRNA delivery using lipid nanoparticles. PNAS. 2025;122(42):e2516573122.
[2] Watanabe S, et al. In Vivo Genetic Manipulation of Spermatogonial Stem Cells and Their Microenvironment by Adeno-Associated Viruses. Stem Cell Reports. 2018;10(5):1551–1564.
[3] Michaelis M, et al. In vivo microinjection and electroporation of mouse testis. J Vis Exp. 2014;(90):51802.
[4] AAV-mediated gene therapy restores natural fertility and improves physical function in the Lhcgr-deficient mouse model of Leydig cell failure. Cell Proliferation. 2024. DOI: 10.1111/cpr.13680.
[5] Mazaud Guittot S, et al. The proximal Gata4 promoter directs reporter gene expression to Sertoli cells during mouse gonadal development. Biol Reprod. 2007;76(1):85–95. DOI: 10.1095/biolreprod.106.055137.
